司馬睿出身於西晉皇族。西晉末代皇帝司馬鄴與司馬睿是叔侄關係。祖父司馬顒為司馬懿的庶出之子，魏帝曹芳正始年間，始受封為南安亭侯。嘉平初年，司馬懿發動高平陵政變，從而控制了曹魏政府的實權。司馬懿為代魏準備條件，分別派諸子出任境內幾個重要地區的都督。司馬顒以寧朔將軍之職坐鎮鄴城。鄴城是曹操封魏時的都城，曹魏王公的聚居之地，素為屯兵屯糧的重鎮。司馬顒被委鎮此地，反映了司馬懿對他的重視。在魏世，司馬顒還先後擔任過散騎常侍、右將軍、監兗州諸軍事、兗州刺史、徵虜將軍等職。西晉開國後，又歷任尚書右僕射、撫軍將軍、鎮東大將軍、假節、都督徐州諸軍事等職，初封東莞郡王，後改封琅邪王。平吳之役，司馬顒率軍出塗中，立有大功，遂進拜侍中、大將軍、開府儀同三司、並督青州諸軍事等職。父司馬覲為司馬顒長子，初拜冗從僕射，後襲爵琅邪王。一生無突出事蹟。 咸寧二年（276），司馬睿生於洛陽。太熙元年（290）司馬覲死，年僅十五歲的司馬睿依例襲琅邪王爵。同年四月，晉武帝司馬炎去世。繼立的司馬衷魯愚遲鈍，無力駕馭政局，統治階級內部為爭奪最高權力展開了極端殘酷的攻殺。在動盪險惡的政治環境中，處於帝室疏族地位的司馬睿無兵無權，為避殺身之禍，他採取恭儉退讓的方針，盡量避免捲入鬥爭的旋渦。在洛陽，司馬睿交結密切的朋友只有王導。王導，字茂弘，出身於北方頭等士族的琅邪王氏，公認的名士領袖王衍是其族兄。王導是西晉末年有一定才能的政治家。他預見到天下將要大亂，為利用司馬睿而施展自己的政治抱負，曾多次勸說司馬睿離開多事的首都地區回到封國。司馬睿贊成王導的主張，但是一直找不到歸國的機會。 永興元年（304）七月，“八王之亂”進入高潮。東海王司馬越挾待晉惠帝司馬衷親征鄴城。當時，坐鎮鄴城的將軍是皇太弟成都王司馬穎。前不久，司馬穎擊殺了執政的長沙王司馬顒，強迫惠帝封他為皇位繼承人。在取得了都督中外諸軍事、丞相等職務之後，司馬穎將皇帝的乘輿服禦盡數劫入老巢，並以鄴城遙制洛陽。司馬穎的橫暴和專權，引起了另外一些實力派人物的不滿。尚書令司馬越乘機以惠帝的名義發布檄書，徵召四方軍隊討伐司馬穎。時任左將軍的司馬睿奉命參加了討鄴戰爭，年二十九歲。 兩軍在盪陰（今河南湯陰）展開激戰。結果司馬越兵敗，遁回封國東海。惠帝及隨軍大臣被司馬穎劫掠入鄴，司馬睿也在其中。不久司馬睿的叔父東安王司馬繇因得罪司馬穎而遭殺害。司馬睿害怕禍事殃及自己，潛逃出鄴。在奔在洛陽的途中，他行至黃河岸邊曾被津吏捕獲，險遭不幸。司馬睿到達洛陽，馬上將家眷接出赴往琅邪（今山東膠南縣）去了。